Holenderscy badacze łączą CRISPR i bioluminescencję w testach eksperymentalnychchoroba zakaźna

Zdaniem naukowców z Holandii nowo opracowane białko nocne mogłoby przyspieszyć i uprościć diagnozowanie chorób wirusowych.
Ich badanie, opublikowane w środę w ACS Publications, opisuje czułą, jednoetapową metodę szybkiej analizy wirusowych kwasów nukleinowych i ich wyglądu przy użyciu świecących jasnoniebieskich lub zielonych białek.
Identyfikacja patogenów poprzez wykrywanie ich odcisków palców kwasów nukleinowych jest kluczową strategią w diagnostyce klinicznej, badaniach biomedycznych oraz monitorowaniu bezpieczeństwa żywności i środowiska.Szeroko stosowane ilościowe testy łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) są bardzo czułe, ale wymagają zaawansowanego przygotowania próbki lub interpretacji wyników, co czyni je niepraktycznymi w niektórych placówkach opieki zdrowotnej lub placówkach o ograniczonych zasobach.
Ta grupa z Holandii powstała w wyniku współpracy naukowców z uniwersytetów i szpitali w celu opracowania szybkiej, przenośnej i łatwej w użyciu metody diagnostyki kwasów nukleinowych, którą można zastosować w różnych warunkach.
Inspiracją dla ich projektów były błyski świetlików, poświaty świetlików i maleńkie gwiazdy fitoplanktonu wodnego, a wszystko to napędzane zjawiskiem zwanym bioluminescencją.Ten efekt świecenia w ciemności jest spowodowany reakcją chemiczną z udziałem białka lucyferazy.Naukowcy wbudowali białka lucyferazy w czujniki emitujące światło, aby ułatwić obserwację po znalezieniu celu.Chociaż sprawia to, że czujniki te idealnie nadają się do wykrywania w miejscu opieki zdrowotnej, obecnie brakuje im wysokiej czułości potrzebnej do klinicznych testów diagnostycznych.Chociaż metoda edycji genów CRISPR może zapewnić taką możliwość, wymaga ona wielu etapów i dodatkowego specjalistycznego sprzętu, aby wykryć słaby sygnał, który może występować w złożonych, zaszumionych próbkach.
Naukowcy znaleźli sposób na połączenie białka związanego z CRISPR z sygnałem bioluminescencyjnym, który można wykryć za pomocą prostego aparatu cyfrowego.Aby upewnić się, że próbka RNA lub DNA jest wystarczająca do analizy, naukowcy przeprowadzili amplifikację polimerazy rekombinazy (RPA) – prostą technikę, która działa w stałej temperaturze około 30°F.Opracowali nową platformę zwaną czujnikiem luminescencyjnego kwasu nukleinowego (LUNAS), w której dwa białka CRISPR/Cas9 są specyficzne dla różnych sąsiadujących części genomu wirusa, a każdy z nich ma przyłączony powyżej unikalny fragment lucyferazy.
Gdy obecny jest specyficzny genom wirusa, który badają badacze, dwa białka CRISPR/Cas9 wiążą się z docelową sekwencją kwasu nukleinowego;zbliżają się do siebie, umożliwiając utworzenie nienaruszonego białka lucyferazy i emitowanie niebieskiego światła w obecności substratu chemicznego..Aby uwzględnić substrat zużywany w tym procesie, badacze zastosowali reakcję kontrolną, która emitowała zielone światło.Próbka zmieniająca kolor z zielonego na niebieski oznacza wynik pozytywny.
Naukowcy przetestowali swoją platformę, opracowując test RPA-LUNAS, który wykrywaRNA SARS-CoV-2bez żmudnej izolacji RNA i wykazał skuteczność diagnostyczną na próbkach wymazów z nosogardzieliCOVID 19pacjenci.RPA-LUNAS z powodzeniem wykrył SARS-CoV-2 w ciągu 20 minut w próbkach z wiremią RNA wynoszącą zaledwie 200 kopii/µl.
Naukowcy uważają, że ich test może łatwo i skutecznie wykryć wiele innych wirusów.„RPA-LUNAS jest atrakcyjnym narzędziem do przeprowadzania przyłóżkowych testów na obecność chorób zakaźnych” – napisali.